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BCM-3514
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Envoyée par : Étudiant(e) Biochimie
Répondue par : Jean-Sébastien Parent
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2007-04-21
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Question
#438
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Bonjour, je me demandais s'il est possible de m'expliquer plus en détail la diapo no 74 concernant la localization, tyrosine phosphorylation, and ubiquitination of the E-cadherin complex in ts-SrcMDCK cells ainsi, que la diapo 83 portant sur la PTP-Substrate Trapping Procedure.
Je vous remercie d'avance. |
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Réponse
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Salut. La diapositive 74 montre le résultat d’une expérience qui sert à montrer l’effet des tyrosines kinases (TK) sur l’adhésion cellulaire.La protéine E-cadhérine (E-cad) est effectivement importante pour les jonctions cellule-cellule comme on le constate à l’image D (immunofluorescence de E-cad) où elle est située à la jonction des cellules agglomérées. Les cellules utilisées ont la particularité d’activer la TK Src lorsqu’elles sont soumises à des températures permissives de 35 degrés. On observe alors que les cellules se détachent les unes des autres et E-cad se retrouve dans les endosomes (internalisation). Il semble donc que l’activation de la TK change la localisation de la E-cad, ce qui change le mode d’adhésion cellulaire. Les Western Blot en b et c montre les résultats d’immunoprécipitation. On constate que la E-cad forme un complexe avec la B-caténine et que les deux protéines sont ubiquitinées et phosphorylées sur une tyrosine. Ces deux dernières modifications pourraient donc être responsable de l’internalisation de la E-cad.
Dans le cas de la diapositive 83, on illustre une technique permettant l’identification de substrat de Protéine Tyrosine Phosphatase (PTP). Cette technique consiste à créer des protéines PTP mutante pour un ou plusieurs résidus catalytiques. Cette mutation n’affecte pas ou peu l’affinité de la protéine pour ses substrats, mais empêche l’hydrolyse du lien tyrosine-phosphate ce qui fait que le substrat et l’enzyme restent liés. On produit donc la protéine mutante fusionnée à l’étiquette GST dans une bactérie et on l’incube avec un lysat cellulaire où se retrouvent les substrats à identifier. Les cellules lysées peuvent avoir été traitées au pervanadate qui augmente l’activité des Protéine Tyrosine Kinase qui produiront alors plus de protéines phosphorylées. Le lysat et la protéine-fusion sont donc incubés ensemble et passés sur colonne pour retenir les protéines-GST et les substrats qu’elles ont retenus. Cette purification permettra alors d’identifier les substrats recherchés par diverses méthodes. Un bon article sur le sujet peut être trouvé au lien plus bas.
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