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BCM-2502
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Envoyée par : MIE
Répondue par : Franck Gallardo
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2007-10-25
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Question
#455
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en quoi consiste la technique du "run-on"? et en quoi differe telle ds les résultats a une northen/southern blot ? |
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Réponse
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Bonjour,
Commençons par le Southern-blot. Cette technique te permet de visualiser des fragments d’ADN par hybridation avec une sonde radioactive. Cette technique est utilisée pour déterminer la présence/absence d’un fragment X dans le génome, le nombre de copie d’un gène X, ou la longueur d’un fragment d’ADN (par exemple : mesure de la longueur des télomères). Si tu sais que ton gène X est présent, tu peux mesurer le niveau d’expression total de son transcrit par Northern blot. Tu extrais les ARN totaux et tu réalises quasi le même protocole que le Southern. Tu fais migrer une quantité X d’ARN que tu hybrides avec une sonde. Les bandes ainsi révélées après autoradiographie reflètent le niveau TOTAL d’ARN du gène X.
Imagine maintenant que tu as 2 échantillons d’ARN de 2 expériences différentes, et que la mesure du niveau total d’ARN par Northern te donne une différence d’un facteur 10 ou plus entre tes 2 échantillons. Plusieurs possibilités peuvent être envisagées : la transcription du gène X a augmenté ou la stabilité de ton ARN a augmenté. C’est a ce point ci que la technique du run on est utile.
En effet, tu peux mesurer les capacités de transcription de tes cellules en les incubant avec un nucléotide radiomarqué. L’incorporation de ce nucléotide radiomarqué dans les chaines ARN naissantes te donnera une idée du taux de transcription in vivo de tes cellules (on réalise cette méthode en général sur des noyaux isolés et l’initiation de la transcription est bloquée par ajout d’inhibiteurs comme l’héparine par exemple). On incube donc les cellules avec le nucleotide radiomarqué et la cellule va terminer de produire les transcrits en cours en incorporant le NT radiomarqué. Ensuite tu extrais les ARN et tu les incubes avec une membrane qui porte une sonde non-radioactive pour ton gène d’intérêt. Au final tu auras un signal qui reflète la régulation transcriptionnelle de ton gène X, ce que ne peux pas faire le Northern-blot.
Pour résumer, le Northern-blot te donne la concentration relative totale d’un ARN X dans une population cellulaire, le run on te donne une idée de la régulation de la transcription de ton gène X.
J’espère avoir répondu à ta question
A bientôt
Franck
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