Envoyé par : Autre
Répondu par : Franck Gallardo
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2007-11-14 |
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Bonjour
j'ai une question en biologie moléculaire. en fait j'ai un plasmide et je veux integrer un duplexe d'ADN dans ce plasmide. mon duplexe contient les sites de restriction en 5' (SpeI) et en 3' (XhoI). quand je regarde mon plasmide j'ai seulement le site de SpeI et pas de site de XhoI. je me demande donc comment dois je faire pour itégrer mon duplexe dans cette situation? (en sachant qu'il n'y a pas de possibiliter de changer la séquence de duplexe) merci par avance |
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Salut,
Les 2 sites sont incompatibles, il va falloir trouver une autre methode. 1: tu fais une PCR sur ton fragment que tu veux cloner et dans les oligos de PCR tu rajoutes tes sites de restrictions Spe et Xho. Ton fragment aura alors quasi la meme taille avec tes 2 sites aux extremites. Pense a aujouter entre 6 et 8 nucleotides apres ton site de restriction pour faciliter la coupure. Tu clones ensuite ton fragment dans ton plasmide. 2: tu digere ton fragment et ton plasmide avec tes 2 enzymes, ensuite tu les "blunt" avec une DNA polymerase de ton choix. Tes deux fragments plasmide et insert sont alors a bout francs et tu les clones ensemble. Attention a l;orientation si tu les clones en blunt. A bientot et bonne chance Franck |
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