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BCM-3514
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Envoyée par : Etudiant(e) Sciences biologiques
Répondue par : Marieke Rozendaal
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2010-02-09
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Question
#530
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bonjour
1- je ne comprends pas vraiment l'expérience de retard sur gel qui demontre l'importance de l'espacement entre les motifs répétés.
2- dans la partie 3, diapo 137 j'ai du mal a comprendre les résultats |
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Réponse
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Bonjour,
Pour comprendre l'expérience de retard sur gel, regardons premièrement la contrôle négative (puit 2: VDR sans compétiteurs). On voit ici que la sonde marquée est retardée dans le gel car elle est liée par VDR. Maintenant la question qui est posée: quels motifs peuvent compétitionner avec le DR3 pour la liaison de VDR. Étant donné que les compétiteurs ne sont pas marqués P32, on le les verra pas sur gel. Une compétition peut être observée comme une diminution du signal VDR-DR3 (car le VDR qui lie le compétiteur ne pourra plus lier le DR3). Ceci est donc logiquement le cas quand on utilise un DR3 non marqué comme compétiteur. Ensuite on peut voir que VDR lie ni le DR4, ni le DR5 lie façon très efficace (pas de diminution du signal VDR-DR3 comparé au contrôle négatif à faible concentration, ou petite diminution à haute concentration). Le GDR3 n'est pas lié du tout.
Pour comprendre l'importance de l'espacement il ne faut pas oublier que les trois motifs, DR3, DR4 et DR5 sont identiques sauf pour l'espacement des demi-sites:
DR3: PuGGTCAnnnPuGGTCA
DR4: PuGGTCAnnnnPuGGTCA
DR5: PuGGTCAnnnnnPuGGTCA
Les DR3 est lié de façon très efficace et le DR4 et DR5 ne le sont pas. L'espacement est donc important.
Pour les résultats de la diapo 137:
La figure à gauche démontre une expérience de GST-pulldown: Le LBD du VDR, fusionné avec GST, a été incubé avec des extraits nucléaires, en présence et absence du ligand. Gardes en tête: les extraits contiennent tout le complexe DRIP-TRAP-Médiateur. Le gel qu'on voit contient les protéines purifiées par GST-pulldown. On voit que le complexe DRIP-TRAP-Médiateur lie le LDB uniquement en présence de ligand. Cette expérience ne permet pas de voir quelle(s) protéine(s) lie(nt) directement. C'est donc ce qu'on va déterminer avec une deuxième expérience.
À droite on voit encore une expérience de GST-pulldown, mais cette fois-ci le GST-VDR-LBD a été incubé avec des produits de transcription/traduction in vitro. Il y a donc a chaque fois juste une seule protéine du complexe présente. Ceci nous permet donc de conclure que dans le complexe dRIP-TRAP-Médiateur, c'est DRIP205 qui lie directement le LBD du VDR de façon ligand-dépendante.
J'espère que ça répond aux questions, sinon, n'hésites pas de poster une autre question!
Bonne continuation,
Marieke.
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