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BCM-3514
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Envoyée par : Étudiant(e) Biochimie
Répondue par : Marieke Rozendaal
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2010-04-18
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Question
#555
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Bonjour,
En concernant le diapos 23 et 25 du cours de 12 avril, vous pouvez me dire c'est quoi la différence entre la recombinaison homologue knock-out vs knock-in?
Et dans le diapos 35 du cours 12 avril, je suis complètement perdu. Je ne sais pas comment expliquer tous ces étapes?
Merci beaucoup! |
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Réponse
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Bonjour,
Knock-out: utilisé pour éliminer un gène ou un exon d'un gène d'intérêt.
Knock-in: utilisé pour remplacer un exon enodgène par un qui porte une mutation qu'on veut étudier. (On insère quelque chose qui nous intéresse)
(Source de l'image: Manis JP, N Engl J Med. 2007 Dec 13;357(24):2426-9; http://content.nejm.org/cgi/content/full/357/24/2426)
Pour le RMCE (Recombinase-mediated cassette exchange): Cette méthode est utilisé pour insérer un gène à un endroit précis dans le génome. Cela permet donc de choisir le contexte epigénétique dans lequel on veut étudier le gène.
Étape 1: Transfection stable de la première cassette (L1CAS1L2). L'intégration sera aléatoire et des analyses doivent être faites pour déterminer le site d'intégration et de choisir des clones qui ont intégré la cassette à la bonne location dans le génome.
Étape 2: Co-expression du vecteur avec le gène d'intérêt (L1CAS2L2) et le plasmide d'expression pour le CRE recombinase.
Maintenant, deux options existent. Il y aura soit recombinaison homologue entre les deux sites L1, soit entre les deux sites L2. Dans les deux cas le gène d'intérêt est intégré dans le génome à l'endroit prédéterminé. (Avant la première cassette dans le cas de L1, après dans le cas de L2.)
Ensuite, un deuxième événement de recombinaison homologue aura lieu. Cela va exclure une des deux cassettes du génome. (Laquelle dépend de quels sites étaient utilisés pour les deux recombinaisons homologues, voir la figure du diapo 35.) Dans le cas d'exclusion de la cassette 1: RMCE réussi, on a intégré le gène d'intérêt et éliminé le marqueur initial. Dans le cas d'exclusion de la cassette 2: ré-exclusion du gène, RMCE pas réussi.
En utilisant des marqueurs fluorescents (dans l'exemple: rouge pour cassette 1 et vert pour cassette 2) on peut sélectionner les cellules dans lesquelles on a eu du RMCE (par cytométrie en flux).
J'espère que tu es moins perdu maintenant!
Bonne chance!
Marieke.
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