|
BCM-1521
|
Envoyée par : Etudiant(e) Sciences biomédicales
Répondue par : Franck Gallardo
|
2007-10-25
|
Question
#454
|
Bonjour,
J'espère que ça va bien. J'aurais quelques questions pour vous:
1)lors d'une électrophorèse, les protéines initialement chargées négativement, migrent vers l'anode jusqu'au moment où ils atteignent leur pI. Alors, leur charge et donc mobilité électrophorétique devient nulle. Ma question est comment font les protéines pour acquiérir des charges positives?
2) Pourriez-vous me confirmer si l'élution fractionnée lors d'une chromatographie consiste à laver la colonne plusieurs fois avec des solutions salines à concentration grandissante.
3) En ce qui concerne les méthodes pour mesurer l'activité enzymatique, elles peuvent être continues ou discontinues. Lorsqu'elles sont continues, l'enzyme couplé avec son substrat, produit un produit coloré, observable en temps réel. Pour la méthode couplée, ajoute-t-on les deux enzymes et le substrat initial dans la même cuve dès le départ?
Pour les méthodes discontinues, sont-elles toujours indirectes?
Merci d'avance |
|
Réponse
|
Salut
réponse à la première question:
Tu parles du principe d’électrofocalisation
L’électrofocalisation est une méthode qui sépare les protéines suivant leur point isoélectrique, pI. Les protéines sont des molécules amphothères, elles peuvent être chargées positivement, négativement ou ne pas avoir de charge selon le pH de la solution dans laquelle elles se trouvent. La charge nette d’une protéine est la somme des charges négatives et positives de ses extrémités et des chaînes latérales des acides aminés qui la composent. Le point isoélectrique correspond au pH où la charge nette de la protéine est égale à 0. Les protéines sont chargées positivement à pH inférieur à leur pI et négativement à pH supérieur
En solution, les protéines sont chargées. Lorsqu’on les soumet à un gradient de pH, sous l’influence d’un champ éléctrique :
les protéines chargées positivement migrent, à travers le gradient de pH, vers la cathode en perdant, au fur et à mesure, leurs charges positives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu’elles atteignent leur pI.
les protéines chargées négativement migrent, à travers le gradient de pH, vers l’anode en perdant, au fur et à mesure, leurs charges négatives pour arriver à une charge nette nulle lorsqu’elles atteignent leur pI. Si elles diffusaient au delà de ce point isoélectrique, elles seraient à nouveau chargées et elles reviendraient à cette valeur
C'est pourquoi dans le applications utilisant les proteines comme par exemple quand tu fais un western blot, nous faisons migrer les proteines avec du SDS (sodium dodecyl sulfate) qui va se fixer sur tes proteines et uniformiser leur charges négativement. De ce fait, leur migration dépendra uniquement de leur poids moléculaire.
Référence: http://www.ifr122.cnrs.fr/spip.php?article176
Deuxième question:
Par définition, l’élution fractionnée consiste à récupérer ton éluât en collectant des fractions et non un éluât total. Tu peux faire de l’élution fractionnée avec beaucoup de paramètres différents comme par exemple avec des tampons de solution salines croissantes, de concentration en urée croissante ou en gardant le même tampon d’élution mais en mesurant le temps que met ton produit a sortir de la colonne de chromato (par exemple avec des tampons contenant de l’HCl) Ton produit d’intérêt sera alors retrouvé dans une fraction particulière et pourra être comparé a d’autres produits sortant dans les fractions précoces (ultrasensibles) ou tardives (peu sensible)
Certaines techniques de chromatographie actuelles utilisent cette méthode de façon systématique comme par exemple les techniques d’HPLC (High pressure liquid chromatography)
Troisième question:
Pour la méthode couplée, le produit synthétisé par la première enzyme est incolore et tu as besoin de la deuxième enzyme pour le doser. Les 2 enzymes sont ajoutées en même temps et le produit de la première sert de substrat pour la deuxième. Ceci te donne une idée de la concentration de départ en substrat puisque tu admets que la réaction est stoïchiométrique (1substrat donne un produit)
Pour ta deuxième question je pense que tu parles des méthodes de détection et il en existe des directes. Il est possible que certaines enzymes clivent des substrats en produits dosables directement par spectrophotométrie ou fluorométrie. Si ce n’est pas le cas, tu couples ta première réaction a une deuxième réaction enzymatique qui elle produira un produit dosable.
Regarde sur la figure 6 de ton codex page 124, si le H2O2 était directement dosable, la détection serait directe, mais tu la couple a une autre réaction qui produit un chromogène, c’est donc une méthode de détection indirecte.
J’espère avoir répondu a tes questions
A bientôt
Franck
|
| Informations |
Question consultée 6495 fois. | 4562 votes, Moyenne 470732.9/5.0 | À vous de voter => min      max |
|
Étudiants
