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BCM-1501-A
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Envoyée par : Étudiant(e) Biochimie
Répondue par : Martin Audet
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2006-11-08
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Question
#405
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Pourriez vous réexpliquer la digestion partielle et complète des enzymes de restriction et comment calcule-t-on les fragments obtenus ? |
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Réponse
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Bonjour,
Prenons un fragment d'ADN contenant 2 sites de restriction EcoRI. Du début jusqu'au premier site de restriction, on a le fragment A. Du premier site de restriction jusqu'au deuxième, on a le fragment B. Et du deuxième site de restriction jusqu'à la fin, on a le fragment C.
Lorsque l'on fait une digestion complète avec une enzyme de restriction, TOUS les sites de cette enzyme seront coupés sur CHAQUE molécule d'ADN en solution. Ainsi, dans notre exemple, les 2 sites EcoRI seront coupés sur toutes les copies de molécules d'ADN présentes dans notre tube à essai. L'analyse de la digestion sur gel va montrer que toutes nos copies de molécules d'ADN sont coupées en 2 endroits. Comme un fragment linéaire coupé en 2 endroits donne 3 fragments, 3 fragments seront détectés sur un gel. Dans notre exemple ce sera les fragment A, B et C.
Lorsque l'on fait une digestion partielle, ça se complique un peu. Chaque site de restriction peut ou ne peut pas être coupé simultanément avec les autres sites sur la même molécule d'ADN. Si on prend l'ensemble des copies de molécule d'ADN dans le tube à essai, voici ce que l'on obtient: une petite fraction seulement des copies de molécules d'ADN dans le tube à essai aura les deux sites EcoRI clivés. Une autre fraction aura seulement le premier site de clivé. Pour un autre fraction, se sera le deuxième site. Et finalement, pour la dernière fraction, aucun clivage n'aura lieu. Si on prend notre exemple, on détectera l'ensemble de ces possibilités:
Pour la fraction des molécules dont les deux sites sont clivés, les fragments A, B et C seront détectés séparément.
Pour la fraction des molécules dont seul le premier site EcoRI est clivé, le fragment A sera détecté seul et les fragment B+C seront détectés en fusion.
Pour la fraction des molécules dont seul le deuxième site EcoRI est clivé, les fragments A+B seront détectés en fusion et le fragment C sera détecté seul.
Pour la fraction des molécules dont aucun site EcoRI n'a été clivé, les fragments A+B+C seront détectés en fusion, soit la molécule original d'ADN intacte!
Donc si on observe sur gel l'ensemble des fragments obtenus en solution après la digestion partielle EcoRI on a ceci:
Fragment A, Fragment B, Fragment C, Fragment A+B, Fragment B+C et Fragment A+B+C.
On obtient donc 6 fragments de longueurs différentes que l'on observe sur gel comme étant 6 bandes distinctes.
Martin
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