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BCM-3512
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Envoyée par : Hadda F
Répondue par : Jean-Sébastien Parent
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2006-09-26
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Question
#372
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est ce que vous pouvez m'expliquer la technique du GST-Pull down svp? est ce qu'elle marche seulement in vitro?
Merci |
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Réponse
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La technique de GST-pull down est souvent utilisée lorsque l’on désire détecter des interactions entre deux protéines. L’interaction forte existant entre la Gluthatione et la Gluthatione-S-transférase (GST) est mise à profit dans ce genre d’expérience. Passons à travers des étapes qui constituent l’exemple décrit dans les notes de cours. L’étape I consiste à exprimer les protéines de fusion dans la bactérie E. coli. L’étape II met tout de suite à profit le tag de GST en purifiant les constructions séparément en utilisant la molécule de Gluthatione liée à un support solide (des billes de Sépharose dans l’exemple). La matrice solide est cruciale puisqu’elle permet de séparer nos protéines à l’étude du reste du surnageant. À l’étape III, une des deux protéines de fusion (B) est séparée du GST-tag par clivage à la thrombine (une séquence de coupure était incluse dans la construction). La GST-tag coupée est alors récupérée grâce à la Gluthatione toujours attachée à la matrice solide de Sépharose et le surnageant, qui contient la protéine B, est conservé. Le surnageant est mélangé avec la protéine de fusion A-GST qui est toujours attachée à la matrice de Sépharose (étape IV). Dans le cas où les protéines interagissent, la protéine B sera désormais liée à la matrice de Sépharose par la protéine A. Si les protéines n’interagissent pas, la protéine B se retrouvera alors dans le surnageant qu’on peut tester par SDS-PAGE.
Il est également possible d’exprimer la construction dans un organisme d’intérêt pour un test in vivo. Cette technique peut être utilisée pour purifier les interacteurs de la protéine dont on a fait la construction. Les cellules sont lysées et l’extrait cellulaire est passé sur le support de Gluthatione (une colonne par exemple) et la protéine de fusion est retenue avec ses différents interacteurs. Les protéines sont dénaturées et chargées sur SDS-PAGE. Les bandes récupérées peuvent être identifiées par spectrométrie de masse. J'attache un lien internet sur lequel tu peux trouver une illustration de ce genre d'utilisation de la GST. J'espère avoir répondu à tes questions.
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