|
BCM-3514
|
Envoyée par : bouzaid
Répondue par : Jean-Sébastien Parent
|
2006-04-06
|
Question
#350
|
bonjour. pour l'étude des domaines SH2 on fait GST PULL DOWN. Pour les proteines a SH3 on fait arrays. mais pour les interactions des proteines a domaines PH quelle methode utilise t'on pour montrer son interaction avec la bicouche lipidique?merci.
c quoi far western blotting?merci |
|
Réponse
|
Salut, dans le cas des domaines PH, des essais de centrifugation ont été faits pour prouver l’interaction du domaine en question avec la membrane. Le principe est très simple, le domaine PH (100 acides aminés) est incubé dans un tube avec des vésicules. Ces vésicules contiennent les différents lipides qui pourraient interagir avec le domaine. Une fois l’incubation terminée, une centrifugation est faite pour récupérer la fraction membranaire précipitée ainsi que la fraction surnageante. Un simple test de quantification des protéines indique alors la proportion de PH libres (surnageant) et de PH liés (membranaire). Différents lipides ont été testés, les résultats peuvent être consultés dans :
Harlan, J.E. et al. Nature 1994, (371) 168.
Un autre article très intéressant donne plus de détails sur la méthode et ajoute même un test de spécificité dans :
Garcia, P. et al. Biochemistry 1995, (34) 16228.
Dans le cas de la technique de Far-Western Blotting, elle ressemble beaucoup à celle du Western Blotting. Alors qu’un Western met l’accent sur l’interaction entre une protéine et un anticorps, le Far-Western teste l’interaction protéine-protéine. La protéine « proie » (contenue dans l’extrait protéique) est séparée des autres protéines par électrophorèse sur gel dénaturant ou non. Les protéines du gel peuvent ensuite être transférées sur membrane ou non, dépendant de la fragilité de l’interaction protéine-protéine. La particularité du Far-Western c’est qu’en lieu de l’anticorps primaire, on incube la membrane (ou le gel) avec la protéine « appât » qui a été produite in vitro ou purifiée. La protéine « appât » peut être détectée directement si elle est marquée avec un isotope radioactif ou indirectement avec un anticorps attaché à un enzyme pouvant être détecté facilement. Voici un modèle qui peut t’aider à comprendre
|
| Informations |
Question consultée 5421 fois. | 4177 votes, Moyenne 3/5.0 | À vous de voter => min      max |
|
Étudiants
