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BCM-2504
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Envoyée par : Étudiant(e) Bioinformatique
Répondue par : Martin Audet
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2006-03-30
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Question
#347
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Bonjours,
J’ai des questions:
1-Dans la 3 eme page de cour , c’est quoi le «delta delta G », et puis les valeurs calculer pour chaque sbtulisine muté est par apport a quoi, même chose pour le type sauvage, le « delta delta G » est calculer par apport a quoi ?
2-dans la 5eme page de 2 eme partie, « spécificité des protéases a serine ….. »Pour le tableau, est ce que on regarde juste les valeurs des rapports (kcat/km) Ser / (kcat/km) Asp pour conclure sur la spécificité de la protéase.
3- est ce que une valeur se kcat/km élevé, signifie une grande spécificité ?
4-dans la page 7 de la 2eme partie, je ne comprends pas comment on a pu conclure a partir du tableau que lys 189 est inactive sur des substrats lys et Arg., et que elle est aussi inactive sur des substrats Asp. ou Glu ?
5-c’est quoi la poche oxyanionique ?
6-pouvez vous me donner une explication pour les courbes qui sont dans les pages 11, 12,13, je n’arrive pas vraiment a faire la relation entre la courbe et la réaction ?
7-dans la 1ere partie de cour, la page 12 « présence d’un acyl enzyme » je n’ai pas bien compris le petit graphe, pouvez vous me donner une explication ?
8-dans le mécanisme à 3 étapes, page 14 de la 1ere partie, pourquoi on fait intervenir un substrat intermédiaire ?
Ca veut dire quoi un résidu isosterique ?
Pour la protéase a serine l’Elastase, est ce qu’elle n’a pas de site de coupure ?
9- dans la page 26de la 1er partie, « Evolution divergente et convergente des protéases a serine », je ne comprends pas vraiment le paragraphe, pouvez vous m’expliquer un peu ?
10-c’est quoi la différence entre la poche oxyanion et l’oxyanion tétraédrique des états des transitions ?
11-pourquoi on utilise les kcat/km pour décrire la spécificité ? Et c’est quoi a différence entre un substrat modèle et une protéine dans la page30 de la 1ère partie ?
12-c’est quoi la différence entre dégradation et hydrolyse limité ?
merci de me repondre. |
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Réponse
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1- Le delta G double croix est la différence d’énergie libre entre l'état initial d’une réaction enzymatique et son intermédiaire réactionnel à l’état de transition (voir p.8 des note de cour de la partie I du cour Révision de la catalyse enzymatique). Le delta delta G est la différence entre le delta G avec l’enzyme wt (Asn 155) et les enzymes mutantes (voir p.4 des notes de cour de la partie III Mécanismes et spécificité). Tu peux ainsi remarquer que le delta delta G dans la colonne de l’enzyme wt est égal à zéro.
2- Oui. Ici par contre on conclu sur la capacité de l'enzyme mutante Ser 189 à cliver des substrats typiques des protéases à sérine.
3- Oui. Dans le cas d'une valeur de kcat/Km d'une enzyme A qui est plus élevé pour un substrat S1 que pour un substrat S2, l'enzyme a une plus grande spécificité pour le substrat S1. Dans cas d’une valeur kcat/Km d’une enzyme A pour un substrat S qui est plus élevé qu’une valeur kcat/Km d’une enzyme B pour un substrat S, on dit alors que le substrat S est spécifique pour l’enzyme A.
4- Les données ne sont pas dans le tableau.
5- La poche oxyanionique des protéases c’est le site de liaison sur l’enzyme de l’oxygène anionique de l'intermédiaire tétraédrique de la réaction. (voir site web et p.21 des notes de cour de la partie III Mécanismes et spécificité)
http://www.med.unibs.it/~marchesi/pps97/course/section12/serprot3.html.
P.S. Les autres réponses aux 7 autres questions s'en viennent bientôt.
Martin
Voici la suite des réponses (désolé si il est tard) :
6- Les différents graphiques de ces pages montrent le taux de la réaction enzymatique en fonction du pH. Il faut se représenter les différents acides aminés nécessaires à l’activité de l’enzyme qui ont besoin d’être au bon état d’ionisation pour un fonctionnement optimal. Sur tous les graphiques, on observe que le plus haut taux de réaction est autour d’un certain pH et que s’en éloigner entraîne une réduction de ce taux. La Cys de la triade catalytique des protéases à cystéine, par exemple, doit être sous sa forme S- et non SH pour être active dans la réaction (pour faire son attaque nucléophile), donc la concentration faible de la forme S- à pH acide explique le fait que l'activité de l'enzyme diminue à pH acide.
7- Deux « petits graphes » se retrouvent dans cette section. On voit sur quelques diapositives le graphique de la concentration des deux produits de la réaction en fonction du temps. Au début de la réaction, la chymotrypsine retrouve son substrat (PNPA) en excès et la liaison covalente donnant l’acyl-enzyme se forme rapidement. Cette réaction rapide est illustrée par l’apparition rapide de l’ion p-nitrophénolate. Pour hydrolyser un deuxième substrat l'enzyme doit terminer l'étape limitante de la réaction avec le premier substrat, on atteint donc la phase stationnaire et la vitesse de réaction ne dépend que de l’hydrolyse de l’acyl-enzyme, on voit alors s’accumuler l’acétate. Le dernier graphique de la section montre la vitesse d’apparition du p-nitrophénolate (donc la formation de l’acyl-enzyme) à différentes concentrations d’enzyme. Puisque l'extrapolation au temps zéro donne une quantité d'enzyme toujours égale à 63% de la concentration d'enzyme introduite dans la réaction, on peut conclure que l'enzyme est active à 63%.
8- a)Comme il est expliqué à la question #7, la dégradation du PNPA par la chymotrypsine se fait en deux phases. Les équations s’appliquant aux réactions classiques ne peuvent s’appliquer ici, il faut modifier l’équation en y ajoutant une « flèche » menant à un nouvel état. Ceci permet alors l’introduction d’une seconde constante de vitesse qui représente la première pente du graphique du taux de la réaction. b) Des résidus non-identiques sont dits isostériques s’ils occupent un volume semblable dans l’espace. c) L’élastase coupe à un site spécifique de même que la trypsine et la chymotrypsine. Dans son cas, elle préfère un très petit résidu (alanine ou glycine) en position P1.
9- Lorsqu’on retrouve des protéines ayant une même fonction mais des séquences primaires différentes, il peut s’agir d’évolution convergente ou divergente. Dans le cas où les deux enzymes ont un gène ancestral commun, comme la trypsine et la chymotrypsine, ce sont les mutations accumulées à travers l’arbre philogénique qui ont rendu les protéines différentes. Il s’agit alors d’évolution divergente puisque les protéines deviennent de plus en plus différentes. Par contre, dans le cas de la subtilisine et de la chymotrypsine qui n’ont pas d’origine commune, ils ont subi la pression sélective du milieu et adopté une même structure 3D, c’est de l’évolution convergente. Deux protéines deviennent de plus en plus semblables puisqu’elles doivent réaliser la même tâche.
10- Lorsque le groupe hydroxyle de la Ser195 attaque le carbone du substrat, un oxygène se retrouve avec une charge négative supplémentaire. Cet atome est alors l'oxyanion de l'intermédiaire tétraédrique puisqu’il y a 4 atomes directement attachés au carbon du carbonyl initial. Cet oxygène chargé est stabilisé grâce à deux groupes amides qui stabilisent l'oxyanion par des ponts hydrogènes et ces deux groupes amides forment ainsi la poche de l’oxyanion.
11- a) L'explication a été clairement dérivée dans le cours à l'aide d'équations mathématiques. b) Dans l’étude de ces réactions enzymatiques, il est très souhaitable d’avoir un substrat ou un produit qui est rapidement et facilement mesurable. Dans ce cas, le modèle est une molécule fluorescente (AA-MCA) qui nous permet donc de mesurer l’apparition du produit de la catalyse. Une protéine disponible en grande quantité peut également être utilisée mais son hydrolyse sera plus difficilement mesurable.
12- Des enzymes comme les exopeptidases vont couper un à un les résidus de la protéine à partir d’une extrémité jusqu’à ce que la protéine soit complètement dégradée. Il n’y a pas de spécificité de séquence, éventuellement il ne restera que des acides aminés libres. Les endopeptidases coupent à l’intérieur même du peptide (comme le nom l’indique) et à une séquence bien spécifique. Lorsque toutes ces séquences ont été coupées, la catalyse s’arrête. Il s’agit donc d’une hydrolyse limitée.
J'espère que cela t'aidera. Bonne chance!
Jean-Sébastien
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